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恒遠生物|雞免疫球蛋白M(IgM)ELISA實(shí)驗說(shuō)明

更新時(shí)間:2024-06-07   點(diǎn)擊次數:248次

檢測范圍:

 

150ng/ml - 5000ng/ml

 

使用目的:

 

本試劑盒用于測定雞血清、血漿及相關(guān)液體樣本中免疫球蛋白M(IgM)含量。

 

實(shí)驗原理

 

本試劑盒應用雙抗原夾心法測定標本中雞免疫球蛋白M(IgM)水平。用純化的抗原包被微孔板,制成固相抗原,往包被的微孔中依次加入免疫球蛋白M(IgM),再與HRP標記的抗原結合,形成抗原-抗體-酶標抗原復合物,經(jīng)過(guò)徹-底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的免疫球蛋白M(IgM)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長(cháng)下測定吸光度(OD值),通過(guò)標準曲線(xiàn)計算樣品中雞免疫球蛋白M(IgM)濃度。

 

標本要求

1.標本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻進(jìn)行,提取后應盡快進(jìn)行實(shí)驗。若不能馬上進(jìn)行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融

2.不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的(HRP)活性。

 

操作步驟

1.標準品的稀釋?zhuān)罕驹噭┖刑峁┰稑藴势芬恢?,用?hù)可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

4800ng/ml 5號標準品 150μl的原倍標準品加入150μl標準品稀釋液

2400ng/ml 4號標準品 150μl的5號標準品加入150μl標準品稀釋液

1200ng/ml 3號標準品 150μl的4號標準品加入150μl標準品稀釋液

600ng/ml 2號標準品 150μl的3號標準品加入150μl標準品稀釋液

300ng/ml 1號標準品 150μl的2號標準品加入150μl標準品稀釋液

2.加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。

3.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

4.配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用

5.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿(mǎn)洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。

6.加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。

7.溫育:操作同3。

8.洗滌:操作同5。

9.顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色10分鐘.

10.終止:每孔加終止液50μl,終止反應(此時(shí)藍色立轉黃色)。

測定:以空白孔調零,450nm波長(cháng)依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后15分鐘以?xún)冗M(jìn)行。

 

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